Adipocyty neboli tukové buňky jsou hlavními hráči při ukládání energie, produkci hormonů a metabolické kontrole. Pokud tyto buňky nefungují správně, mohou vést k obezitě, inzulínové rezistenci a metabolickému syndromu. Výzkumníci zkoumající metabolické léčby přesunuli své zaměření na syntetický produkt s malou molekulou známý jako 5 amino 1mq peptidová injekcekterá se zaměřuje na konkrétní enzym známý jako nikotinamid N-methyltransferáza (NNMT). Tento enzym je velmi rozšířený v tukové tkáni, a proto jsou adipocyty vhodnou modelovou buňkou pro zkoumání účinku 5 amino 1mq na metabolismus v molekulárním měřítku.
1. Obecná specifikace (skladem)
(1) API (čistý prášek)
(2) Tablety
(3) Vstřikování
(4) Kapsle
(5) Kapalina
2. Přizpůsobení:
Budeme jednat individuálně, OEM/ODM, žádná značka, pouze pro vědecké zkoumání.
Interní kód:KP-3-5/002
NNMTi CAS 42464-96-0
Molekulární vzorec: C10H11N2.I
HS kód: N/A
Molekulová hmotnost: 286,11
Číslo EINECS: 464-196-0
Hlavní trh: USA, Austrálie, Brazílie, Japonsko, Německo, Indonésie, Velká Británie, Nový Zéland, Kanada atd.
Analýza: HPLC, LC{0}}MS, HNMR
Technologická podpora: Oddělení výzkumu a vývoje-4
Pochopení toho, jak tato chemikálie ovlivňuje tukové buňky, může poskytnout zásadní pohled na kontrolu hmotnosti, výdej energie a metabolické zdraví. Velké množství dat o procesech 5 amino 1mq při modulaci buněčného metabolismu bylo odvozeno z laboratorních výzkumů izolovaných adipocytů, diferencovaných buněčných linií a tkáňových kultur. Tento článek pojednává o vědeckých technikách používaných při zkoumání dopadu injekce 5 amino 1mq peptidu na metabolismus adipocytů, včetně inhibice enzymů, řízení lipidů a buněčné diferenciace.
Proč se NNMT studuje na adipocytech s 5 aminokyselinami 1MQ?
Role NNMT ve funkci tukových buněk
Enzym zvaný nikotinamid N-methyltransferáza (NNMT) mění nikotinamid, typ vitaminu B3, na N-methylnikotinamid. Tento proces využívá S-adenosylmethionin (SAM), což je donor methylu, který tělo potřebuje všude, a vyrábí S-adenosylhomocystein (SAH). Může se to zdát jako jednoduchá biochemická reakce, ale má obrovský vliv na to, jak buňky využívají energii. Nikotinamid adenindinukleotid (NAD+), chemická látka potřebná pro tvorbu energie a fixaci buněk, je přímo ovlivněna působením NNMT.
Exprese NNMT je velmi vysoká v adipocytech, zejména u lidí s nadváhou. Nízká množství NAD+ jsou způsobena vysokou aktivitou NNMT, která zhoršuje výkon mitochondrií a snižuje spotřebu energie. To nastavuje metabolismus tak, že je pravděpodobnější, že tuk bude ukládat, než spalovat.
Studie ukázaly, že hladiny NNMT jsou až třikrát vyšší v tukové tkáni u obézních lidí než v štíhlé tkáni, což z tohoto enzymu dělá přitažlivý cíl pro metabolickou intervenci.
Jak5 amino 1 mqInteraguje s NNMT
5-Amino-1-methylchinolin je chemická látka, která byla vyrobena, aby zabránila působení NNMT. Když vědci vloží 5amino 1mq peptid do adipocytových kultur, molekula se naváže na aktivní místo NNMT a zabrání mu v methylaci nikotinamidu. To přestane něco fungovat, což rychle zvýší množství NAD+ uvnitř buněk. To zapíná sirtuiny, skupinu proteinů, které řídí metabolismus, záněty a stárnutí buněk.
Pomocí 3T3-L1 adipocytů, běžné buněčné linie odvozené z myších embryonálních fibroblastů, v laboratoři výzkumníci prokázali, že jejich ošetření 10-mikromolární 5amino 1mq zvyšuje hladiny NAD+ asi 2,3krát během 48 hodin. Když se hladiny NAD+ opět zvýší, spustí se řetězec biochemických změn, díky nimž mitochondrie lépe fungují a nakloní energetickou rovnováhu buňky směrem k rozkládání energie namísto jejího budování.
Metodologické přístupy ve výzkumu NNMT
Ke studiu redukce NNMT v adipocytech vědci používají řadu různých metod. Pomocí kapalinové chromatografie-hmotnostní spektrometrie (LC-MS) ke sledování produkce N-methylnikotinamidu zjišťují testy enzymové aktivity, jak dobře 5 amino 1mq snižuje funkci NNMT. Western blotting a fluorescenční barvení ukazují, že množství NNMT proteinů a signálních molekul jako SIRT1 a PPAR-gama se změnilo.
Použití metabolického profilování ke zjištění, jak blokování NNMT mění metabolismus v adipocytech, poskytuje úplný obrázek. Výsledky těchto studií ukazují, že podání injekce 5 amino 1mq peptidu výrazným způsobem mění hladiny metabolitů, které se účastní glykolýzy, cyklu trikarboxylových kyselin a metabolismu mastných kyselin.
Tato úroveň hloubky molekulární analýzy pomáhá výzkumníkům zjistit nejen to, zda redukce NNMT funguje, ale také to, jak mění metabolismus buněk.
Jak 5 Amino 1MQ Research zkoumá metabolismus adipocytů?
Sledování cest syntézy lipidů
Metabolismus lipidů zahrnuje dva procesy, které fungují proti sobě: lipogenezi (tvorba tuku) a lipolýzu (odbourávání tuku). Adipocyty jsou nejlepší buňky pro studium obou procesů, protože ukládají triglyceridy, když mají energii navíc, a uvolňují mastné kyseliny, když nemají dostatek energie. Vědci používají izotopové-značené substráty ke sledování pohybu živin uvnitř buněk, když studují, jak injekce 5aminových 1mq peptidu mění metabolismus lipidů.
Radioaktivním nebo stabilním izotopem-značená glukóza a acetát se přidávají do kultur adipocytů ošetřených 5 amino 1mq. Výzkumníci poté změří, kolik z těchto označených uhlíků se zabuduje do nově syntetizovaných mastných kyselin a triglyceridů. Studie trvale prokázaly, že inhibice NNMT snižuje de novo lipogenezi snížením regulace klíčových enzymů, jako je syntáza mastných kyselin (FAS) a stearoyl-CoA desaturáza-1 (SCD1).
Analýza genové exprese potvrzuje, že tyto enzymy se po 72 hodinách léčby při normálních laboratorních dávkách snižují o 40–55 %.
Měření oxidace mastných kyselin
Na druhém konci metabolismu lipidů oxidace mastných kyselin rozkládá tuky, které byly uloženy k výrobě energie. Většinou se tento proces odehrává v mitochondriích a peroxisomech. Výzkumníci používají radioaktivně značenou kyselinu palmitovou ke sledování produkce oxidu uhličitého a molekul rozpustných v kyselině -, aby zjistili, jak dávka 5 amino 1mq peptidu ovlivňuje spalování tuků. Vyšší rychlost oxidace znamená, že buňky rychleji spotřebovávají uložené tuky.
Experimentální data z primárních lidských adipocytů ukazují, že léčba 5 amino 1 mq zvyšuje expresi karnitin palmitoyltransferázy 1A (CPT1A), enzymu, který přesouvá mastné kyseliny do mitochondrií ke spálení. Během 96 hodin po léčbě se hladiny mRNA CPT1A zvýší asi o 60 % a metabolické analyzátory Seahorse ukazují, že spotřeba kyslíku stoupne o 45 %. Tato zařízení monitorují buněčné dýchání v reálném čase, což je přímý důkaz zvýšené mitochondriální aktivity.
Studie stimulace lipolýzy
Kromě syntézy a oxidace vědci také zkoumají, jak snadno adipocyty uvolňují uložené lipidy prostřednictvím lipolýzy. Tento proces zahrnuje sekvenční působení adipózní triglyceridové lipázy (ATGL), hormonálně -senzitivní lipázy (HSL) a monoacylglycerollipázy (MGL). Léčba s5 amino 1mq peptidová injekceaktivuje tyto enzymy jak přímou regulací transkripce, tak nepřímou signalizací prostřednictvím vyšší aktivity NAD+ a SIRT1.
Testy uvolňování glycerolu měří lipolýzu počítáním množství glycerolu v růstovém médiu. Glycerol je vedlejším produktem rozkladu triglyceridů. Když se k adipocytům přidá 5 amino 1 mq, uvolňují glycerol rychlostí o 35–50 % vyšší než normální buňky. To znamená, že lipidy jsou mobilizovány rychleji.
Tato zvýšená lipolýza se děje bez jakéhokoli extra hormonálního vstupu, což naznačuje, že blokování NNMT může samo o sobě posunout adipocyty do metabolicky aktivnějšího stavu.
5 Injekce peptidu Amino 1MQ a diferenciace adipocytů: Co ukazují buněčné modely?
Diferenciace adipocytů, která je také známá jako adipogeneze, je proces, při kterém preadipocyty, což jsou rané tukové buňky, rostou do zralých tukových buněk. Genová exprese, morfologie a metabolické schopnosti, to vše se během tohoto posunu hodně mění. Zjištění, jak injekce 5 amino 1mq peptidu změní tento proces, nám pomůže zjistit, zda inhibice NNMT nemění pouze to, jak fungují stávající tukové buňky, ale také jak se tvoří nové.
3T3-L1 nebo modely lidských mezenchymálních kmenových buněk jsou často používány výzkumníky ke studiu adipogeneze. K diferenciaci buněk se používá směs inzulínu, dexamethasonu a isobutylmethylxanthinu. Během diferenciace je některým léčebným skupinám podáváno 5 amino 1 mq. Bližší pohled mikroskopem ukazuje, že blokování NNMT snižuje hromadění lipidových kapiček. To je měřeno výzkumníky pomocí barvení Oil Red O, což je metoda, která specificky označuje neutrální lipidy.
Molekulární studie ukazuje, že injekce 5 amino 1mq peptidu blokuje klíčové hráče v adipogenezi, včetně PPAR-gama a C/EBP-alfa. Tyto transkripční faktory řídí aktivitu několika stovek genů, které jsou potřebné pro zrání adipocytů. Stav acetylace PPAR-gama se mění, protože aktivita SIRT1 stoupá, když je aktivita NNMT během diferenciace zablokována. To způsobuje změny v transkripční aktivitě. Studie ukazují, že když se buňky vyvíjejí v přítomnosti látky, produkce adipogenních markerů, jako je adiponektin a leptin, klesá o 30–45 %.
Důležité je, že tento výzkum odhaluje, že na načasování záleží. Přidání 5 amino 1 mq k buňkám v rané fázi procesu diferenciace má silnější účinky než přidání poté, co se buňky již rozhodly stát se adipocyty. Tato přesnost v čase naznačuje, že by mohla být použita k zastavení nadměrného růstu tukové tkáně a zároveň umožnit současným buňkám zlepšit jejich metabolickou funkci.
Jak se studuje lipogeneze a oxidace mastných kyselin s 5 Amino 1MQ?
Zda adipocyty ukládají tuk nebo ho spalují, závisí na tom, jak dobře spolupracují lipogeneze a oxidace mastných kyselin. Aby zjistili obě strany této chemické rovnice, výzkumníci, kteří se zabývají injekcí 5 amino 1mq peptidu, používají metody, které dobře spolupracují. Kvantitativní data z pokročilejších metod ukazují, jak blokování NNMT nakloní tuto rovnováhu směrem k využití energie.
Izotopové indikátory a matematické modelování se používají v experimentech s analýzou toku, aby se zjistilo, jak rychle fungují metabolické dráhy. Vědci krmí adipocyty 13C-značenou glukózou s nebo bez 5 amino 1mq. Poté použijí hmotnostní spektrometrii, aby se podívali na metabolity, které přijdou poté, aby viděli, jak se atomy uhlíku pohybují různými cestami. Tyto studie ukazují, že blokování NNMT snižuje tok uhlíku do syntézy mastných kyselin asi o 35 %, zatímco zvyšuje tok uhlíku cyklem trikarboxylových kyselin o 28 %.
Sekvenování RNA pro monitorování genové exprese vytváří podrobné mapy změn v transkripci. Když je 5 amino 1mq peptid injikován do adipocytů, downreguluje geny, které tvoří tuk (FAS, ACC1, SCD1) a upreguluje geny, díky nimž věci spalují tuk (CPT1A, ACOX1, UCP1). Tento trend ukazuje spíše na základní změnu v metabolismu než na účinky na jednotlivé enzymy. Když se na tyto soubory dat statisticky podíváme, můžeme vidět, že SIRT1 a AMPK jsou klíčovými hráči v signalizační síti, která tyto změny řídí.
Funkční metabolické testy přímo měří, jak buňky využívají energii, což je doplněk k molekulárním datům. Monitory extracelulárního průtoku měří v reálném čase, kolik kyslíku je spotřebováno (což ukazuje oxidační metabolismus) a kolik kyseliny je vytvořeno (což ukazuje glykolýzu). Když někoho ošetříte 5 amino 1mq, vaše bazální spotřeba kyslíku stoupne o 30 až 40 procent a vaše maximální dechová kapacita se zvýší přibližně o stejnou hodnotu. Testy založené na fluorescenčním barvivu- ukazují, že tyto funkční zisky jsou spojeny s vyšší mitochondriální hmotou a lepším potenciálem mitochondriální membrány.
Lipidomický výzkum popisuje všechny různé typy lipidů, které se nacházejí v adipocytech, a odhaluje nejen to, kolik tuku se hromadí, ale také jaké druhy lipidů jsou nejběžnější. Když je NNMT blokován, mění se složení mastných kyselin v buněčných lipidech. Existuje více kratších-řetězců a nenasycených mastných kyselin, které se snadněji odbourávají.
K této změně kvality lipidů dochází současně s poklesem celkového obsahu lipidů. To naznačuje, že dávka 5 amino 1 mq peptidu mění jak množství, tak typ tuků, které se ukládají.
Co mohou modely adipocytů odhalit o 5 aminokyselinách 1MQ a metabolické regulaci?
Modely výzkumu adipocytů jsou složitější než jen buněčná kultura a jsou schopny lépe napodobovat fyziologické podmínky. Složitější modely, jako jsou tyto, pomáhají propojit chemické procesy pozorované v jednotlivých buňkách s možnými účinky v živých věcech. Abychom pochopili, o čem jsou výsledky studie5 amino 1mq peptidová injekceto znamená, že musíte znát klady a zápory různých experimentálních metod.
Tří{0}}dimenzionální kultury adipocytů, které jsou pěstovány ve speciálních strukturách, které umožňují buňkám formovat se do sféroidů, si zachovávají více ze svých fyziologických vlastností než dvou-dimenzionální kultury. Tyto systémy lépe kopírují gradienty kyslíku a živin nacházející se v tukové tkáni a udržují interakce mezi buňkami. Studie využívající 3D kultury ukazují, že blokování NNMT má účinky, které jsou podobné těm, které jsou pozorovány u 2D modelů. Vykazují však také účinky na vzorce uvolňování adipokinu, které jednodušší modely nevykazují. Ve sféroidních buňkách ošetřených 5 amino 1 mq je uvolňování pro-zánětlivých cytokinů, jako je interleukin-6 a monocytový chemoatraktant protein-1, sníženo o 40–50 %. To naznačuje, že 5 amino 1mq má protizánětlivé vlastnosti, které spolupracují s jeho metabolickými účinky. Komplikované buněčné prostředí tukové tkáně lze modelovat metodami kokultivace, které mísí adipocyty s jinými typy buněk, jako jsou vaskulární buňky nebo makrofágy. Tyto testy ukazují, že léčba 5 amino 1mq peptidem má účinky, které přesahují jeho přímé účinky na tukové buňky.
Když adipocyty, které byly ošetřeny 5 amino 1mq, rostou společně s makrofágy, imunitní buňky produkují méně aktivačních markerů a zánětlivých cytokinů. To naznačuje, že metabolická zlepšení v adipocytech mohou mít pozitivní vliv na zánětlivý stav tkáně kolem nich.
Ex vivo studie tkáňových explantátů používají tukovou tkáň, která byla nově separována a udržována v kultuře po krátkou dobu. Tato metoda udržuje tkáňovou strukturu celistvou, včetně extracelulární matrix, zbytků vaskulatury a směsi buněčných populací. Když jsou explantáty lidské subkutánní tukové tkáně ošetřeny 5 amino 1mq po dobu 48 až 72 hodin, mnoho výsledků pozorovaných ve studiích na buněčných kulturách se opakuje: vyšší hladiny NAD+, vyšší spotřeba kyslíku a nižší exprese lipogenních genů. Skutečnost, že výsledky jsou stejné napříč všemi experimentálními modely, zvyšuje pravděpodobnost, že pozorované procesy jsou biologicky důležité a nejsou pouze výsledkem příliš jednoduchých podmínek buněčné kultivace.
Mechanistické studie nalezly v adipocytech specifické signální dráhy, kterými funguje suprese NNMT. Když hladiny NAD+ stoupnou po léčbě injekcí 5 amino 1mq peptidu, dráha AMPK se zapne. Tato dráha řídí energetický stav buněk. Když je AMPK aktivován, fosforyluje a deaktivuje acetyl-CoA karboxylázu, což je klíčový lipogenní enzym. Zároveň urychluje oxidaci mastných kyselin. Výzkumníci potvrzují, že AMPK se podílí na použití specifických aktivátorů a inhibitorů, což prokazuje, že zastavení AMPK snižuje asi o 60 % metabolické účinky způsobené inhibicí NNMT.
Stejným způsobem řídí dráha SIRT1 mnoho efektů, ke kterým dochází po vysokých úrovních NAD+. Tato NAD+-závislá deacetyláza mění mnoho metabolických transkripčních faktorů, jako je FOXO1, PPAR-gama a PGC-1alfa. Genetické metody používané ke snížení hladin SIRT1 ukazují, že tento protein je zodpovědný za přibližně 70 % změn v adipocytech, které 5 amino 1mq způsobuje v transkripci.
Tyto nové myšlenky o tom, jak věci fungují, vysvětlují, jak jediný inhibitor enzymu může změnit mnoho metabolických drah současně.
Závěr
Máme mnohem lepší představu jak5 amino 1mq peptidová injekcemění metabolismus na buněčné úrovni díky výzkumu, který využívá modely adipocytů. Vědci stanovili molekulární procesy, které vedou k metabolickým změnám, pečlivým studiem toho, jak blokování NNMT ovlivňuje lipogenezi, oxidaci mastných kyselin a buněčnou diferenciaci. Blokování aktivity NNMT zvyšuje množství dostupného NAD+, což zapíná důležité metabolické regulátory jako SIRT1 a AMPK. Tím se mění metabolismus adipocytů tak, že energii využívají, místo aby ji ukládaly.
Nálezy, které jsou podobné v celé řadě experimentálních systémů, od jednoduchých buněčných kultur po složité tkáňové explantáty, ukazují, že blokování NNMT má silné metabolické účinky. Pokročilé analytické metody nejen ukázaly, že injekce 5 amino 1mq peptidu mění metabolismus adipocytů, ale také přesně ukázaly, jak k těmto změnám dochází na molekulární, biochemické a funkční úrovni. Toto-hloubkové pochopení toho, jak věci fungují, pokládá základy pro pokračující výzkum aplikací pro metabolické zdraví a poskytuje nám užitečné informace o základní biologii metabolismu tukových buněk.
FAQ
1.Proč jsou adipocyty ideální pro studium účinků 5 amino 1mq?
Adipocyty mají mnoho NNMT ve srovnání s většinou ostatních typů buněk, což znamená, že blokování NNMT na tyto buňky funguje nejlépe. Tyto buňky mají také na starosti řízení metabolismu. Dělají to kombinací signálů o dodávce energie a koordinací metabolických reakcí v celém těle. Vzhledem k dobře-známým metodám růstu a diferenciace adipocytů a skutečnosti, že o tom, jak tukové buňky fungují, je toho hodně známo, jsou skvělou volbou pro mechanistický výzkum. Studie na adipocytech ukazují výsledky, které přímo souvisejí s metabolickými zdravotními problémy, jako je inzulínová rezistence a obezita.
2.Jak vědci měří metabolické změny v adipocytech léčených 5 amino 1mq?
Vědci používají mnoho metod, jako je měření aktivity enzymů, analýza genové exprese pomocí kvantitativní PCR a sekvenování RNA, metabolomické sledování pomocí hmotnostní spektrometrie a funkční měření toho, kolik kyslíku se spotřebuje a kolik energie se ztratí. Experimenty se sledováním izotopů sledují živiny, jak se pohybují metabolickými cestami, a metody založené na mikroskopii- ukazují, jak se velikost a tvar lipidových kapiček a mitochondrií v průběhu času mění. Tato multi-modální metoda poskytuje úplný obraz metabolických procesů na buněčné, biochemické a molekulární úrovni.
3. Mohou studie adipocytů předpovědět, jak může 5 amino 1mq fungovat v celém těle?
Dokonce i modely adipocytů jsou užitečné pro pochopení toho, jak věci fungují, jsou příliš jednoduché a nemohou plně napodobit složitost celých organismů. Studie v laboratoři ukazují, že myšlenka je správná a pomáhají nám zjistit, jak to funguje, ale abychom tyto výsledky uvedli do praxe, musíme provést více studií tkáňových systémů a nakonec i živých věcí. Nálezy, které jsou stejné v různých modelech adipocytů, jako jsou buněčné linie, surové lidské buňky a tkáňové explantáty, usnadňují uvěřit, že pozorované procesy jsou biologicky relevantní. Tyto studie na buňkách jsou velmi důležité pro pochopení toho, jak mohou účinky působit na celé tělo.
Partner s Kpeptide: Váš důvěryhodný dodavatel 5-aminových 1MQ peptidových injekcí
Jak postupuje studie o tom, jak funguje metabolismus, Kpeptide je připraven pomoci vašim obchodním a vědeckým projektům s vysoce-kvalitními sloučeninami. Spolupracujeme s továrnami s certifikací GMP-, které pokrývají 100 000 metrů čtverečních, abychom zajistili, že každá šarže5 amino 1mq peptidová injekcesplňuje vysoké standardy kvality. Tyto normy jsou kontrolovány třikrát: v továrně, interním zajištěním kvality a kontrolou kvality a třetí stranou. Již 12 let spolupracujeme s farmaceutickými společnostmi, vědeckými společnostmi a výzkumnými školami ve 24 zemích, což ukazuje, že jsme odhodlaní být spolehliví a odvádět skvělou práci.
Společnost Kpeptide nabízí jasné ceny, různé možnosti balení a rychlou technickou podporu, ať už potřebujete materiály pro výzkum-s úplnými analytickými údaji nebo dodávky, které lze rozšířit pro vývojové projekty. Naše dodavatelské služby 5aminových 1mq peptidových injekcí zahrnují logistiku studeného řetězce-, právní poradenství a důkladné certifikáty pravosti, které vám pomohou urychlit váš výzkum a ujistit se, že dodržujete pravidla. Kontaktujte náš profesionální tým nasales@kpeptide.com mluvit o tom, jak vám můžeme pomoci dosáhnout vašich cílů metabolického výzkumu tím, že vám poskytneme spolehlivé zásoby a budeme s vámi spolupracovat jako s partnerem.
Reference
1. Kraus D, Yang Q, Kong D, a kol. Knockdown nikotinamid N-methyltransferázy chrání před dietou-navozenou obezitou. Příroda. 2014;508(7495):258-262.
2. Ulanovskaya OA, Zuhl AM, Cravatt BF. NNMT podporuje epigenetickou remodelaci v adipocytech modulací hladin SAM. Nature Chemical Biology. 2013;9(5):300-306.
3. Komatsu M, Kanda T, Urai H a kol. Aktivace NNMT může přispět k rozvoji ztučnění jater modulací metabolismu NAD+. Vědecké zprávy. 2018;8:8637.
4. Campagna R, Matějů D, Wojtas M, et al. NNMT potlačuje progresi buněčného cyklu prostřednictvím downregulace CKD1/CCNE1 v bílé tukové tkáni. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2020;532(3):343-349.
5. Brachs S, Polack J, Brachs M, et al. Genetická inhibice nikotinamid N-methyltransferázy potlačuje adipozitu a reguluje energetickou homeostázu. Diabetes. 2019;68(7):1318-1331.
6. Hong S, Moreno-Navarrete JM, Wei X a kol. Nikotinamid N-methyltransferáza reguluje metabolismus živin v játrech prostřednictvím stabilizace proteinu Sirt1. Nature Medicine. 2015;21(8):887-894.
